Метод 1: Метод экстракции (Метод, используемый в настоящее время в моей стране; он обеспечивает более низкую чистоту, но обеспечивает более низкие производственные затраты.)
Экстракция раствора окситоцина: возьмите 100 г высушенного порошка задней доли гипофиза и 30 г кварцевого порошка, поместите их в шаровую мельницу и добавьте дистиллированную воду. Выполните экстракцию четыре раза, используя ту же процедуру. Объемы дистиллированной воды, добавляемой на каждую стадию, следующие: 1,4 л для первых двух экстракций и 1,3 л для последующих двух. Каждую экстракцию проводят в течение 45 минут с последующим центрифугированием для сбора жидкости; оставшийся остаток затем подвергают дальнейшей экстракции. Четыре полученных экстракта объединяют и получают раствор окситоцина. Краткое описание: Сухой порошок задней доли гипофиза [вода, шаровая мельница] → Экстракт окситоцина → Хроматографическое разделение.
Возьмите 1500 г предварительно-обработанного синтетического цеолита, добавьте 20 л 0,25%-ного раствора уксусной кислоты и-после перемешивания-вылейте смесь в ионообменную-колонку. Как только уровень раствора уксусной кислоты упадет до отметки на 2–3 см над поверхностью слоя цеолита, немедленно вводят экстракт окситоцина. Поддерживайте соответствующую скорость потока и собирайте полученный белый мутный элюат (эта фракция в основном содержит окситоцин; поскольку окситоцин имеет изоэлектрическую точку [pI] 7,7-, тогда как вазопрессин имеет pI 10,9-вазопрессин легко образует положительные ионы и, таким образом, адсорбируется на колонке). Как только уровень жидкости экстракта упадет до поверхности слоя цеолита, немедленно добавляют дистиллированную воду и продолжают собирать мутный элюат до прекращения течения. Доведите pH собранного мутного элюата до 3,5, используя ледяную уксусную кислоту. Быстро нагрейте раствор на водяной бане до 95 градусов, поддерживайте эту температуру в течение 3 минут, затем быстро охладите раствор и поставьте его в холодильник на ночь. Вкратце: Экстракт окситоцина [HAc, колонка с синтетическим цеолитом] → Мутный элюат [HAc, Нагревание] → Разделенный раствор → Адсорбция и элюирование. На следующий день отфильтруйте охлажденный раствор. К фильтрату при перемешивании добавьте 10% суспензию бентонита (добавление 3 мл суспензии на 100 мл фильтрата). Продолжайте перемешивать в течение 1 часа для облегчения адсорбции, затем центрифугируйте смесь. Проверьте надосадочную жидкость, используя раствор реагента сульфосалициловой кислоты; отсутствие осадка указывает на завершение процесса адсорбции. Если адсорбция неполная, повторите процесс обработки бентонита; впоследствии объединить осадки бентонита, полученные на обеих стадиях адсорбции. Бентонит элюируют четыре раза 1% уксусной кислотой (объемами 1,6 л, 1,4 л, 1,2 л и 0,8 л соответственно). К каждому элюату добавляют трет-бутилтрихлорид, как только раствор нагревается до 80 градусов; Затем температуру повышают до 95 градусов, быстро охлаждают до 25 градусов и фильтруют или центрифугируют. Четыре полученных фильтрата объединяют для определения активности и предела вазопрессина. Технологическая схема выглядит следующим образом: охлажденный раствор [фильтрация] → фильтрат [бентонитовая суспензия] → адсорбат [1% HAc] → элюат. Приготовление инъекции окситоцина:
Анализируемый раствор окситоцина, соответствующий стандартам качества, разводят до концентрации 5 ЕД/мл или 10 ЕД/мл. Затем его фильтруют через воронку из спеченного стекла №. 4 или №. 5, разливают по ампулам и стерилизуют проточным паром при температуре 100 градусов в течение 30 минут для получения конечного продукта. Технологический процесс выглядит следующим образом: раствор окситоцина (утвержден анализом) [фильтрация, наполнение, стерилизация] → инъекция окситоцина.
Регенерация синтетического цеолита. Синтетический цеолит дважды промывают дистиллированной водой. Затем добавляют 1,5 л воды (в расчете на 500 г цеолита) и 150 г хлорида натрия и смесь перемешивают в течение 2 часов для вымывания и удаления вазопрессина. Затем цеолит промывают дистиллированной водой до тех пор, пока не перестанут оставаться ионы хлорида. Добавляют соответствующее количество воды и доводят pH до 9 с помощью гидроксида натрия; смесь перемешивают в течение 30 минут, после чего надосадочную жидкость декантируют. Цеолит промывают дистиллированной водой, доводят pH до 5,5–6 с помощью серной кислоты и снова промывают водой до практически нейтрального состояния. Затем его фильтруют для удаления лишней воды и сушат при температуре 105 градусов для дальнейшего использования. Перед использованием добавляют необходимое количество воды и регулируют pH с помощью ледяной уксусной кислоты при перемешивании, чтобы обеспечить впитывание. Приготовление 10% бентонитовой суспензии. Бентонит и воду смешивают в соотношении массы-к-1:10. Смесь измельчают примерно в течение 1 часа, в течение этого времени добавляют уксусную кислоту для поддержания стабильного pH 3,5. Полученную суспензию затем хранят в холодильнике для дальнейшего использования. Метод 2: Химический синтез. Сначала синтезируют гептапептид-амид (сегменты 3–9), исходя из бензилоксикарбонил-лейцина *p*-нитрофенилового эфира; далее синтезируется бензилоксикарбонил-S-бензилцистеин-тирозина азид (сегменты 1–2); и на третьем этапе синтезируется окситоцин.